Investigadores do Instituto de Química Física da Academia Polaca de Ciências usaram uma técnica microscópica de muito alta resolução, para seguir as reações químicas que ocorrem em volumes muito pequenos.
O método desenvolvido pelos físicos de Varsóvia em colaboração com a PicoQuant GmbH é o primeiro a tornar potencialmente possível observar reações, não apenas dentro das células vivas, mas mesmo dentro de organelos individuais, como núcleos celulares.
Para os cientistas os mecanismos químicos responsáveis pelas funções vitais da célula continuam a esconder muitos segredos. Recentemente os cientistas têm vindo a dispor de ferramentas para examinar diretamente os fenómenos químicos que ocorrem nas células vivas. Mas devido a limitações técnicas, não foi possível conhecer dados como os valores constantes de equilíbrio das reações químicas nas células.
Os investigadores esclareceram que ainda não é conhecida a quantidade de um químico envolvida numa determinada reação na célula que está numa forma já reagida e quanto está numa forma não reagida.
Mas uma equipa de investigadores do Instituto de Química Física da Academia Polaca de Ciências, em Varsóvia, em colaboração com a empresa PicoQuant GmbH, com sede em Berlim, desenvolveu e demonstrou um modelo baseado numa das técnicas microscópicas mais modernas: a espectroscopia de correlação de fluorescência de muito alta resolução.
Robert Holyst, do Instituto polaco, referiu: “Estamos a lidar há muito tempo com reações químicas nas células. Por exemplo, em 2013, determinamos os coeficientes de difusão de todas as proteínas na bactéria Escherichia coli. Um conhecimento que tornou possível determinar a taxa de reações que ocorrem com a participação destas protaínas. Uma questão semelhante em que estamos interessados é quando há baixas concentrações de reagentes”.
O investigador ainda acrescentou: “As reações biológicas são geralmente reversíveis e, onde elas ocorrem é criado um certo equilíbrio dinâmico entre a quantidade de substâncias reagidas e não reagidas. Nas tentativas para determinar as constantes de equilíbrio para várias reações nas células, olhamos para a espectroscopia de correlação de fluorescência de muito alta resolução, e encontramos um problema técnico interessante cuja solução abriu novas possibilidades para o estudo da química da vida”.
Os investigadores esclareceram que há muitas variedades de microscopia, incluindo as de resoluções tão fenomenais que é possível ver átomos individuais. No entanto, ao observar células, a microscopia ótica permanece imbatível devido à baixa invasividade e à capacidade de visualizar a estrutura espacial dos organismos vivos.
Durante muito tempo o problema para os investigadores foi a resolução dos equipamentos, e as restrições físicas fundamentais tornaram impossível distinguir detalhes menores que 200 nanómetros, por técnicas óticas standards.
Um tipo de microscopia ótica é microscopia de fluorescência. Envolve a introdução de um corante fluorescente nos locais da amostra biológica a ser estudada e, em seguida, a varredura da amostra com um raio laser focado. As moléculas de corante que são focadas são estimuladas a brilhar.
Em 1994, Stefan W. Hell apresentou um método para ultrapassar o limite de difração em microscopia de fluorescência por meio de Depleção de Emissão STIMulada (STED). O STED requer um feixe de laser adicional.
Adequadamente utilizado, este raio extingue as áreas externas do foco principal do raio laser e consequentemente reduz o tamanho para valores abaixo do limite de difração. Com métodos de muito alta resolução, é possível ver detalhes espaciais de apenas 10 nm com uma resolução de tempo de até microssegundos.
Um ramo relativamente novo de microscopia ótica é a Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (ECF), usado para estudar movimento de moléculas. Em variedades de super resolução, o foco do laser tem um volume medido em dezenas de ‘attolitres’ (um ‘attolitre’ é igual a 10−18 do litro). A medida envolve a medição da luz emitida por um corante fluorescente ligado à molécula testada, excitado por um raio laser. Conhecendo o tamanho do foco e a duração da fluorescência, e com a ajuda dos modelos teóricos adequados, é possível determinar com precisão a velocidade das moléculas individuais.
“Já há algum tempo, que sabemos que, enquanto a microscopia ECF de muito alta resolução funciona bem quando observa moléculas que se deslocam em duas dimensões, por exemplo, em membranas lipídicas, mas falha nas observações em volumes. Os tempos de difusão, determinados com base em medidas em 3D, podem ser diferentes das previsões das medidas em 2D por uma ordem de grandeza ou mesmo mais. Após alguns meses de pesquisa, ficou claro para nós que, para essas discrepâncias eram devidas à maneira excessivamente simplificada de determinar o tamanho espacial do foco “, referiu o investigador Krzysztof Sozanski do instituto polaco.
Com base nas suas próprias análises e experiências teóricas, os investigadores de Varsóvia, financiados pela subvenção (bolsa) MAESTRO, do Centro Nacional de Ciências da Polónia e pela ERA do programa europeu Horizonte 2020, construíram um novo modelo teórico universal que introduz uma correção da forma espacial do foco tendo em conta o seu impacto na relação sinal / ruído. A correção do modelo foi inicialmente verificada em medidas da taxa de difusão de várias sondas fluorescentes em soluções.
“Nós também realizamos experiências mais avançadas. Por exemplo, estudamos uma reação reversível em que as moléculas de corantes se uniram às micelas (estrutura globular formada por um agregado de moléculas anfipáticas) e depois se separaram após algum tempo. O sistema, composto por bolas relativamente grandes de moléculas surfactantes que reagem com as moléculas de corante, condições refletidas características das estruturas biológicas”, indicou o investigador doutorando, Xuzhu Zhang.
Os investigadores explicaram que as medidas não eram simples. Se as moléculas de ambos os reagentes se movessem lentamente, ao passar pelo foco, o foco poderia juntar / desconectar repetidamente com / a partir das micelas e a luz emitida seria média. Mas também pode haver uma variante do outro extremo: as reações de conexão e desconexão podem ser tão lentas que, durante a transição através do foco, não haveria alteração na relação entre os reagentes – então não haveria cálculo da média.
“O modelo leva em consideração não só os casos extremos, mas também todos os intermediários. E com o conhecimento à nossa disposição sobre o tamanho real do foco, podemos mudar seu tamanho e examinar experimentalmente todos os casos necessários pelo modelo tanto no mesmo sistema químico quanto no mesmo equipamento “, enfatizou Zhang.
Uma característica importante do método analítico desenvolvido no Instituto de Química Física da Academia Polaca de Ciências é o fato de que não são necessárias alterações nos equipamentos para sua aplicação. Após a adaptação apropriada, o método pode ser usado para interpretar mais precisamente os dados gravados pelos microscópios STED prontos para ECF já produzidos, concluíram os investigadores.
